Struttura complementare mRNA vaccine. Relazione di valutazione Rolling Review del relatore

Sommario

Informazioni amministrative. 4

1. Riepilogo esecutivo. 11

1.1. Portata della presentazione della revisione progressiva. 11

Nuovo stato della sostanza attiva. 11

1.2. Il programma di sviluppo / conformità alla guida / consulenza scientifica del CHMP. 11

1.3. Commenti generali sulla conformità a GMP, GLP, GCP. 11

1.4. Tipo di domanda e altri commenti sul fascicolo presentato. 11

2. Panoramica scientifica e discussione sui nuovi dati 12

2.1. Aspetti qualitativi 12

2.1.1. introduzione. 12

2.1.2. Sostanza attiva. 12

Informazioni generali 12

Fabbricazione, controlli di processo e caratterizzazione. 13

Specifiche, procedure analitiche, standard di riferimento, analisi dei lotti e chiusura dei contenitori 19

Stabilità. 22

2.1.3. Prodotto medicinale finito. 22

Descrizione del prodotto e sviluppo farmaceutico. 22

Fabbricazione del prodotto e controlli di processo. 26

Specifiche del prodotto, procedure analitiche, analisi dei lotti 28

Stabilità del prodotto. 32

Protocollo (i) di gestione delle modifiche successive all'approvazione. 33

Agenti avventizi 33

OGM.. 34

N / A. 34

Nuovi eccipienti 34

2.1.4. Discussione e conclusioni sugli aspetti chimici, farmaceutici e biologici 34

2.2. Aspetti non clinici 35

2.2.1. Farmacologia. 35

2.2.2. Farmacocinetica. 39

2.2.3. Tossicologia. 42

2.2.4. Ecotossicità / valutazione del rischio ambientale. 43

2.2.5. Discussione su aspetti non clinici 44

2.2.6. Conclusione sugli aspetti non clinici 49

2.3. Aspetti clinici 49

2.4. Piano di gestione del rischio. 49

2.5. Sistema di farmacovigilanza. 49

3. PANORAMICA SCIENTIFICA E DISCUSSIONE sulle risposte alle domande sollevate nei cicli precedenti 50

4. Valutazione del rischio dei benefici 50

5. Elenco delle domande del relatore. 50

5.1. Aspetti qualitativi 50

Grandi obiezioni 50

Altre preoccupazioni 51

5.2. Aspetti non clinici 60

Grandi obiezioni 60

Altre preoccupazioni 60

5.3. Aspetti clinici 67

5.4. Piano di gestione del rischio. 67

5.5. Sistema di farmacovigilanza. 67

5.6. Nuovo stato della sostanza attiva. 67

6. Condizioni raccomandate per la futura autorizzazione all'immissione in commercio e informazioni sul prodotto in caso di valutazione positiva del rapporto rischi / benefici 67

7. Appendici (a seconda dei casi). 67

Sviluppo del processo di produzione

I dati per questa sezione sono in sospeso.

Storia dello sviluppo e comparabilità

Due processi DS sono stati utilizzati durante la storia dello sviluppo; Processo 1 e 2. Vengono forniti dettagli sulle differenze di processo, le giustificazioni per apportare modifiche e i risultati di uno studio di comparabilità. I principali cambiamenti tra DS Process 1 e 2 sono; aumento della scala del processo, modello di DNA cambiato da un modello PCR a DNA plasmidico linearizzato, purificazione con biglie magnetiche sostituita con digestione della proteinasi K e passaggi UFDF.

Nello studio di comparabilità è stata osservata una diminuzione dell'integrità dell'RNA per i lotti del Processo 2 rispetto ai lotti del Processo 1 (78,1-82,8% rispetto al 59,7%). Dopo la regolazione dei parametri di processo per i volumi CTP e ATP, il lotto 20Y513C501 (PPQ3) è stato prodotto con un livello di integrità dell'RNA del 75%, più coerente con i lotti del processo 1.

Per quanto riguarda l'estremità del tappo da 5 'del DS, la caratterizzazione LC-UV / MS ha confermato che le strutture con limite di 5' e non ricoperte sono le stesse nel Processo 1 e 2, ma che c'è un leggero spostamento verso livelli di limite di 5 'più alti nel Processo 2. Questo è ritenuto accettabile.

Inoltre, la coda poli (A) dell'estremità 3 'è stata caratterizzata da LC-UV / MS. I segmenti attesi corti (A30) e lunghi (L70) della coda poli (A) sono stati osservati dopo la scissione dell'RNasi T1. Sebbene i risultati per il segmento A30 si siano dimostrati comparabili tra i lotti di Processo 1 e Processo 2, sono state identificate differenze significative per il segmento L70. Come previsto, è stata osservata eterogeneità della coda di poli (A) sia per i lotti di Processo 1 che di Processo 2, a causa dello slittamento trascrizionale. Code di poli (A) più lunghe sono state osservate per il lotto del Processo 2, mentre i segmenti L70 più abbondanti del lotto del Processo 1 hanno dimostrato di contenere un residuo di citidina aggiuntivo. Sono state osservate differenze nel pattern della coda in poli (A) durante il confronto tra i batch Process 1 e Process 2 DS. Le differenze nell'entità dell'incorporazione della citidina monofosfato e dello slittamento trascrizionale devono essere ulteriormente studiate e dovrebbe essere discusso il possibile impatto sull'efficacia e sulla sicurezza. L'unico processo 2 DS incluso nel confronto è stato prodotto prima dell'adeguamento dei volumi CTP e ATP. Devono essere presentati anche i risultati ottenuti sui lotti PPQ prodotti dopo la regolazione (PPQ 3, 4 e 5).

La sequenza primaria complessiva della sostanza farmacologica BNT162b2 è stata dimostrata comparabile mediante la mappatura LC / MS / MS -oligonucleotidi. La spettroscopia di dicroismo circolare (CD) è stata utilizzata per valutare la struttura di ordine superiore di BNT162b2 in soluzione. È stato dimostrato che i batch di processo 1 e processo 2 DS sono molto simili.

Per dimostrare la funzionalità, la dimensione della proteina dopo l'espressione in vitro della sostanza farmacologica BNT162b2 è stata determinata utilizzando Western blot. Le dimensioni delle proteine ​​espresse si sono dimostrate comparabili tra i lotti del Processo 1 e del Processo 2. Tuttavia, il metodo è descritto solo brevemente e la rilevanza dei risultati è quindi difficile da valutare.

Attributi critici di qualità (CQA)

Viene fornito un riepilogo degli attributi di qualità con la motivazione dell'assegnazione di criticità. La motivazione per la classificazione in CQA o QA è presentata per ogni attributo e appare ragionevole. I CQA identificati sono; Integrità dell'RNA, cappuccio 5 ', coda Poly (A), stampo di DNA residuo e RNA a doppio filamento (dsRNA). Da notare, per le code poli (A), sia la percentuale di molecole di mRNA positivo Poly (A) che la lunghezza delle code poli (A) sono considerate CQA. Una preoccupazione correlata viene sollevata in S.4.

Sviluppo e caratterizzazione dei processi

I dati per questa sezione sono in sospeso.

Vengono presentati la discussione dei modelli scale-down così come l'approccio, i risultati e le conclusioni degli studi di caratterizzazione del processo. Gli approcci adottati per identificare i parametri di processo critici (CPP) sono anche descritti e in generale trovati accettabili. Da notare, la valutazione si basa sui dati attualmente presentati e quindi a questo punto non è possibile effettuare la valutazione finale della strategia di controllo. Va inoltre notato che le modifiche future a uno qualsiasi dei parametri di processo elencati in S.2.2, indipendentemente dalla classificazione di CPP o non CPP, dovrebbero essere applicate come applicazioni di variazione.

Inizialmente, i volumi di aggiunta per ATP e CTP sono stati identificati come non CPP poiché entrambi erano forniti in eccesso teorico. A seguito delle campagne GMP di Pfizer e di ulteriori studi su piccola scala, è stato dimostrato che questi volumi potevano essere limitanti e gli intervalli sono stati ampliati all'estremità superiore. L'approccio per modificare solo il limite superiore degli intervalli deve essere ulteriormente giustificato e chiarito. Si noti che dopo la regolazione di questi volumi la percentuale di integrità dell'RNA è stata aumentata a livelli più coerenti con i lotti del Processo 1.

Nella fase di trascrizione in vitro (IVT) vengono aggiunti T7 RNA polimerasi e pirofosfatasi per avviare la reazione. I blocchi costitutivi del ribonucleotide sono assemblati dalla polimerasi T7. La polimerasi T7 dipende dal magnesio, ma il magnesio può essere chelato dal pirofosfato rilasciato mediante l'aggiunta di ciascun ribonucleotide alla catena in crescita. La pirofosfatasi viene utilizzata per mantenere livelli sufficienti di magnesio libero abbattendo il pirofosfato. Si sostiene che i volumi aggiunti di questi due enzimi siano stati identificati come non CPP poiché hanno maggiori probabilità di influire solo sulla resa. Questa conclusione non è concordata, i volumi aggiunti degli enzimi dovrebbero essere classificati come CPP.

Valutazione del rischio di impurità correlate al processo

I dati per questa sezione sono in sospeso.

In questa sezione viene fornita una valutazione del rischio per la sicurezza per le potenziali impurità correlate al processo incluse nel processo della sostanza farmacologica relativa alla sicurezza del paziente. Le potenziali impurità includono piccole molecole, enzimi e la struttura NTP / Capping. Le fonti delle impurità sono sufficientemente affrontate.

La strategia di valutazione del rischio per la sicurezza prevede il confronto tra la concentrazione teorica nel caso peggiore di impurità, presumendo l'assenza di rimozione, con le soglie di preoccupazione di sicurezza calcolate. Se il livello nel caso peggiore di un'impurità supera i limiti di sicurezza predeterminati, tutti i dati disponibili su scala commerciale per l'impurità specifica saranno forniti nella sezione pertinente e come minimo saranno monitorati come parte della convalida del processo per dimostrare una rimozione coerente per livelli accettabili.

È stato calcolato che i livelli peggiori di NTP, tappo 5 ', impurità correlate al processo di piccole molecole, inibitore della RNasi, DNasi I e pirofosfatasi dal processo di produzione della sostanza farmaceutica BNT162b2 sono significativamente inferiori ai limiti di sicurezza predeterminati. Questo è ritenuto accettabile. I livelli di T7 RNA polimerasi e proteinasi K sono stati ulteriormente studiati ed è stato dimostrato che le concentrazioni rilevate nei lotti clinici, fornitura di emergenza iniziale e PPQ BNT162b2 DS erano ben al di sotto della soglia di preoccupazione per la sicurezza. Il richiedente dichiara che i dati verranno forniti per lotti aggiuntivi una volta completato il test. Questo è stato trovato accettabile. Tuttavia, il richiedente deve fornire dati sui livelli di T7 RNA polimerasi e proteinasi K in ulteriori lotti DS su scala commerciale, una volta completato il test.

1. Panoramica scientifica e discussione sui nuovi dati

1.1. Aspetti qualitativi

1.1.1. introduzione

Il prodotto finito si presenta come concentrato multidose senza conservanti da diluire per iniezione intramuscolare, destinato a 5 dosi. Il prodotto finito è una dispersione sterile di nanoparticelle lipidiche (LNP) contenenti RNA in un tampone crioprotettore acquoso contenente 30 µg / dose della sostanza attiva BNT162b2, mRNA 5'capped che codifica la proteina SRAS-CoV-2 Spike a lunghezza intera come sostanza attiva.

Gli altri ingredienti sono: ALC-0315 ((4-idrossibutil) azandiil) bis (esano-6,1-diil) bis (2-esildecanoato), ALC-0159 2 - [(polietilenglicole) -2000] -N, N- ditetradecilacetamide), DSPC (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), colesterolo, saccarosio, cloruro di sodio, cloruro di potassio, fosfato disodico diidrato, fosfato diidrogeno di potassio e acqua.

Il prodotto è disponibile in flaconcini di vetro sigillati con un tappo di gomma bromobutilica e un sigillo di alluminio con cappuccio di plastica a strappo.

1.1.2. Sostanza attiva

Informazioni generali

Il principio attivo è costituito da un mRNA a filamento singolo con cappuccio 5 'che viene tradotto in una sequenza ottimizzata per il codone che codifica per l'antigene spike di SARS-CoV-2. La Figura 1 illustra la struttura generale dell'RNA che codifica per l'antigene: oltre alla sequenza ottimizzata per codone che codifica per l'antigene, l'RNA contiene elementi strutturali comuni ottimizzati per mediare un'elevata stabilità dell'RNA e l'efficienza traslazionale (5'-cap, 5'-UTR , 3'-UTR, poly (A) -tail; vedi sotto). Inoltre, un peptide di segnale intrinseco (sec) fa parte del frame di lettura aperto ed è tradotto come un peptide N-terminale. L'RNA non contiene uridine; al posto dell'uridina, nella sintesi dell'RNA viene utilizzata la N1-metilpseudouridina modificata.

Figura 1. Struttura generale dell'RNA

Fabbricazione, controlli di processo e caratterizzazione

Descrizione del processo di fabbricazione e controlli di processo

Le informazioni sul processo di produzione e sui controlli di processo per il sito di produzione BNT Mainz & Rentschler non sono ancora state fornite. Pertanto, i commenti di seguito sono relativi solo al sito di Andover. Si prevede che non siano previste differenze significative tra i due processi. Tuttavia, l'adattamento minore del processo potrebbe essere accettato a condizione che venga adeguatamente convalidato.

Descrizione generale delle fasi del processo di produzione

Il processo di produzione della sostanza farmaceutica BNT162b2 prevede cinque fasi principali. L'RNA viene prima sintetizzato dal DNA lineare tramite una fase di trascrizione in vitro (IVT). Va osservato che lo stampo di DNA lineare è definito come materiale di partenza e quindi la produzione dello stampo tramite DNA plasmidico non è inclusa nel processo. La fase IVT è seguita da due fasi enzimatiche, ovvero le fasi di digestione della DNasi I e della proteinasi K, che aiutano nella purificazione. L'RNA grezzo viene quindi purificato attraverso una fase di ultrafiltrazione / diafiltrazione (UFDF) a due stadi. Infine, l'RNA subisce un'ultima filtrazione prima di essere erogato e conservato congelato.

Viene fornito un diagramma di flusso, che presenta gli input di processo ei controlli di processo per ogni fase. Lo scopo di ciascuna fase del processo di fabbricazione è sufficientemente descritto. Per ogni fase vengono elencati i tempi di attesa, i parametri di processo ei corrispondenti criteri di accettazione. Si noti che non tutti i parametri di processo sono elencati, ma che gli elenchi includono tutti i parametri di processo critici e diversi parametri di processo non critici. In generale, si conviene che i parametri chiave del processo siano descritti nella sezione 3.2.S.2.2. Tuttavia, per la fase IVT, i volumi aggiunti di gli enzimi T7 polimerasi e pirofosfatasi devono essere considerati critici, a meno che non sia giustificato. Va inoltre notato che le modifiche future a uno qualsiasi dei parametri di processo elencati in S.2.2, indipendentemente dalla classificazione come CPP o non CPP, dovrebbero essere applicate come applicazioni di variazione.

Il richiedente spiega che la durata della membrana UFDF deve ancora essere stabilita e il piano di convalida simultaneo è adeguatamente descritto nel fascicolo.

Trasporto di sostanze stupefacenti

La sostanza farmaceutica viene conservata tra -15 ° C e -25 ° C. Il trasporto utilizzando uno spedizioniere isolato è qualificato per un tempo di spedizione fino a 106 ore a ≤-15 ° C.

Ricondizionamento

Si afferma che se il test di integrità post-utilizzo sul filtro finale da 0,45 / 0,2 μm fallisce, è consentita la filtrazione. È chiaramente definito che il ritrattamento nella fase di filtrazione finale è consentito solo una volta. Questo è ritenuto accettabile.

Scala e definizione dei lotti

Viene spiegato che i lotti di sostanze farmaceutiche su scala commerciale vengono eseguiti su una scala di 37,6 L di volume iniziale per la trascrizione in vitro (IVT). Tutto il materiale prodotto viene purificato da una singola ultrafiltrazione / diafiltrazione a due stadi (UFDF) per produrre la sostanza farmaceutica. Il sistema di numerazione dei lotti è sufficientemente descritto. A ogni batch viene assegnato un numero di batch per l'intero processo. Questo è stato trovato accettabile. Tuttavia, inoltre, dovrebbero essere fornite informazioni sul volume DS finale.

Controllo dei materiali

Viene fornita una panoramica adeguata delle materie prime e delle soluzioni utilizzate nel processo di produzione delle sostanze farmaceutiche. I criteri di accettazione limitata sono inclusi in un formato tabellare per tutte le materie prime, ma dovrebbero essere forniti anche CoA rappresentativi per i materiali non compendiali. In generale, le informazioni fornite sembrano supportare una qualità adeguata delle materie prime, tuttavia, a questo punto vengono sollevate diverse preoccupazioni.

Materie prime:

I materiali di partenza elencati includono la soluzione ATP, la soluzione CTP, la soluzione GTP, la soluzione N1-metilpseudo UTP e la soluzione con tappo da 5 'e lo stampo di DNA lineare. L'approccio è accettabile.

Modello di DNA lineare

La sostanza farmacologica BNT162b2 è prodotta mediante trascrizione in vitro utilizzando uno stampo di DNA lineare, prodotto tramite DNA plasmidico (pST4-1525) da cellule di Escherichia coli DH10B trasformate.

Lo stampo lineare di DNA non fa parte del prodotto finale ma definisce la sequenza del prodotto mRNA ed è quindi fondamentale per garantirne un adeguato controllo. Le modifiche al processo di fabbricazione del modello di DNA lineare (ad esempio, la modifica della cellula ospite del plasmide) possono provocare un diverso profilo di impurità nella sostanza attiva. Pertanto, il livello di dettaglio incluso nel dossier rispetto al processo di fabbricazione e alla strategia di controllo per questo materiale di partenza, sebbene brevemente descritto, non è ancora considerato adeguato per consentire una corretta valutazione.

Gli elementi funzionali del pST4-1525 sono sufficientemente descritti in formati grafici e tabulari e la sequenza è inclusa. Tuttavia, i dettagli riguardanti il ​​ceppo batterico e la fonte e la generazione del plasmide pST4-1525 utilizzato rimangono da documentare.

Vengono descritte le banche cellulari coinvolte nel processo di produzione del plasmide. I test di qualificazione MCB e WCB sono elencati e includono identità morfologica e genotipica, analisi della mappa di restrizione e sequenziamento del DNA, assenza di batteriofagi contaminanti, vitalità, ritenzione plasmidica e numero di copie del plasmide. Vengono impostate le specifiche pertinenti e vengono forniti i dati degli attuali MCB e WCB. Gli MCB plasmidici e i WCB sono arruolati in un programma di stabilità della banca cellulare costituito da saggi di vitalità e ritenzione plasmidica condotti in tutti i punti temporali di stabilità. La strategia è, in generale, considerata adeguata, sebbene siano richiesti alcuni dettagli.

pST4-1525 è prodotto da un processo di fermentazione fed-batch avviato dalla banca di cellule di lavoro batteriche (WCB). Dopo la fermentazione, le cellule vengono raccolte e lisate chimicamente per recuperare il DNA plasmidico. Dopo questa fase di lisi, il DNA plasmidico circolare viene purificato mediante ultrafiltrazione / diafiltrazione e cromatografia a scambio anionico. Il DNA plasmidico circolare viene filtrato mediante filtrazione da 0,2 μm e conservato congelato a una temperatura compresa tra -60 e -90 ° C; il tempo di attesa per questo intermedio non è definito. Il filtrato viene campionato per le specifiche del DNA plasmidico circolare. Dopo lo scongelamento, il plasmide viene linearizzato, concentrato, filtrato e conservato congelato a una temperatura compresa tra -15 e -25 ° C. Non vengono fornite informazioni o dati aggiuntivi per supportare la stabilità. Il filtrato viene campionato per la specifica del templato di DNA lineare. Viene fornito un elenco delle materie prime, nonché delle resine cromatografiche e dei filtri utilizzati nella produzione del modello di DNA lineare. Tutti i materiali utilizzati sono privi di origine animale e provengono da fornitori approvati.

Vengono fornite le specifiche per il DNA plasmidico circolare e per il modello lineare di DNA. Le impurità correlate al processo e al prodotto, inclusi DNA genomico della cellula ospite, RNA, proteine, endotossine, carica batterica e isoforme plasmidiche, per il DNA plasmidico, vengono quantificate regolarmente. Il materiale di riferimento per il test di identità del plasmide non è descritto. I risultati di tre diversi lotti sono forniti per il plasmide circolare e linearizzato ei limiti di specifica proposti sembrano essere giustificati dai dati disponibili ancora limitati. Non sono state ancora fornite descrizioni dei metodi analitici utilizzati per il controllo del modello di DNA lineare né prove riguardanti la loro qualificazione / convalida. Questa informazione è, tuttavia, considerata critica per la qualità del prodotto finale.

Alterazione della nucleoside, ultra dannoso per l'organismo.

Analisi non eseguita sulla stabilità.

Abbreviazioni: NTU = Unità di torbidità nefelometrica; B = marrone; RT-PCR = reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa; ddPCR = PCR digitale a goccia; qPCR = PCR quantitativa; dsRNA = RNA a doppio filamento; LAL = Limulus amebocyte lysate; EU = unità di endotossina; CFU = unità formante colonie

La specifica proposta per la sostanza farmaceutica è generalmente ritenuta accettabile rispetto alle analisi scelte per i test di rilascio di routine. L'integrità dell'RNA CQA, il cappuccio 5 ', la coda Poly (A), lo stampo di DNA residuo e l'RNA a doppio filamento (dsRNA) sono tutti inclusi nella specifica di rilascio. Tuttavia, la lunghezza delle code poli (A) in BNT162b2 DS è importante per la stabilità dell'RNA e l'efficienza traslazionale e pertanto dovrebbe essere inclusa nei test di rilascio di DS. Si noti inoltre che non sono inclusi riferimenti al metodo, questo deve essere aggiornato.

Il test di potenza non è incluso nel controllo di DS, ma viene invece eseguito a livello di rilascio DP. Considerando la natura di questo prodotto, l'approccio è approvato.

Procedure analitiche e standard di riferimento

Procedure analitiche

Tutti i metodi analitici utilizzati per testare la sostanza farmacologica sono descritti nel fascicolo.

I seguenti test vengono eseguiti in accordo con Ph Eur; chiarezza (Ph Eur 2.2.1), colore (Ph Eur 2.2.2), pH (Ph Eur 2.2.3), endotossine batteriche (Ph Eur 2.6.14) e carica batterica (Ph Eur 2.6.12).

Un commento generale che si applica a tutti i metodi analitici non compendiali è che vengono forniti dettagli piuttosto brevi. Alcuni dei metodi analitici non sono presentati in modo sufficientemente dettagliato e spesso le descrizioni dei metodi si basano su "esempi" di procedure, controlli e standard, nonché su parametri operativi "tipici" del sistema. Ciò ostacola una piena comprensione dell'operazione o, a volte, della base scientifica del test. Inoltre, poiché molti di questi test non sono standard e complessi, ciò interferisce con la valutazione dell'idoneità. La mancanza di informazioni sufficienti su reagenti critici, standard o apparecchiature ostacola il controllo normativo degli aspetti critici dei saggi. Vengono sollevate diverse preoccupazioni per analisi specifiche che richiedono informazioni aggiuntive su procedure, reagenti, standard e apparecchiature critici.

Si sostiene che i metodi analitici siano stati convalidati rispetto ai parametri presentati in ICH Q2 (R1). Tuttavia, i riassunti di convalida presentati sono troppo brevi per poter trarre conclusioni sull'idoneità dei metodi analitici interni. La qualità del farmaco BNT162b non può essere adeguatamente valutata, se non è possibile garantire l'affidabilità dei metodi analitici.

L'elettroforesi su gel capillare (CGE) viene utilizzata per determinare la percentuale di integrità dell'RNA sia nella sostanza farmacologica (DS) che nel prodotto farmaceutico (DP). Il campione in esame viene sottoposto a un denaturante contenente formammide che dispiega l'RNA e dissocia i complessi non covalenti. Quando sottoposte a un campo elettrico, le specie di RNA denaturato migrano attraverso la matrice di gel, in funzione della lunghezza e delle dimensioni, verso l'anodo. Un colorante intercalante si lega all'RNA e ai frammenti associati durante la migrazione consentendo il rilevamento della fluorescenza. L'RNA intatto viene separato da qualsiasi specie frammentata consentendo la quantificazione dell'integrità dell'RNA determinando la percentuale relativa dell'area corretta per il tempo per il picco intatto (principale).

La cromatografia liquida di fase inversa ad alte prestazioni (RP-HPLC) viene utilizzata per misurare la quantità relativa di specie di RNA con cappuccio 5 '. I campioni di prova vengono digeriti utilizzando RNase H seguita da purificazione per affinità e (RP-HPLC) con rilevamento UV. Dopo un processo di ricottura a una sonda biotinilata complementare alle ultime 26 basi dell'estremità 5 'dell'RNA, i campioni vengono digeriti con RNasi H, seguita dalla purificazione per affinità basata su matrice di streptavidina dei duplex risultanti dai resti di mRNA molto più grandi. Le specie con cappuccio oligonucleotidico corto e senza cappuccio vengono eluite dalla matrice di streptavidina e la quantificazione relativa del cappuccio da 5 'viene eseguita mediante analisi RP-HPLC dell'insieme di molecole con cappuccio e senza cappuccio di RNA. La quantità relativa di specie limitate viene determinata dividendo il segnale delle specie limitate per il segnale della specie totale.

I metodi analitici interni per CGE e RP-HPLC sono in generale ben descritti e includono dettagli sulle condizioni di test tipiche, parametri operativi, elettroferogrammi e cromatogrammi rappresentativi, nonché informazioni sui test di idoneità del sistema.

Un metodo RT-PCR viene utilizzato per determinare l'identità della sequenza di RNA codificata, una procedura analitica di reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) viene utilizzata per quantificare lo stampo di DNA residuo e una procedura analitica immunoblot viene utilizzata per rilevare l'RNA a doppio filamento (dsRNA) nella sostanza farmaceutica BNT162b2. Tutti questi test sono ritenuti idonei allo scopo previsto e, in generale, sebbene brevi, le descrizioni fornite sono considerate pertinenti. Vengono sollevate diverse preoccupazioni per quanto riguarda dettagli aggiuntivi sulla descrizione del metodo, i controlli e in alcuni casi ulteriori chiarimenti sui criteri stabiliti per supportare l'idoneità del metodo.

La tecnologia ddPCR è proposta per la quantificazione della coda poli (A) nell'acido ribonucleico messaggero (mRNA). La procedura tecnica è considerata, in generale, sufficientemente descritta ma l'idoneità di questo metodo per lo scopo previsto necessita di ulteriori chiarimenti. La logica con cui il metodo determina la percentuale di poli (A) relativa all'input teorico (che non è chiaramente descritto) dovrebbe essere ulteriormente affrontata.

Standard di riferimento

L'attuale standard di riferimento è indicato come il materiale di riferimento clinico (CRM). Si afferma che il CRM sarà utilizzato per le forniture cliniche, la convalida del processo e le forniture commerciali iniziali. Il CRM è preparato dal lotto GMP BNT162b2 DS 20Y513C201. I dati sul rilascio sono presentati nel dossier. La condizione di conservazione prevista è -20 ± 5 ° C, ma viene valutata anche una condizione di conservazione alternativa compresa tra -60 e -90 ° C. Viene fornito un protocollo di stabilità. Esistono diverse preoccupazioni riguardo allo standard di riferimento, inclusa l'idoneità del lotto scelto come CRM, se sono stati utilizzati standard aggiuntivi durante lo sviluppo iniziale e problemi relativi al protocollo di stabilità formale. Dovrebbe anche essere chiarito per quali metodi di test di rilascio e stabilità viene utilizzato lo standard di riferimento e verrà utilizzato in futuro.

In futuro, a Sarà implementato un sistema a due livelli per il futuro materiale di riferimento commerciale. Un PRM e un WRM iniziale saranno stabiliti nel 2021 per il materiale di riferimento della sostanza farmaceutica. Il PRM sarà lo standard rispetto al quale i WRM sono qualificati e il PRM sarà destinato a durare per tutta la durata del prodotto commerciale. Il richiedente afferma che in futuro verranno fornite ulteriori informazioni sulla selezione, preparazione, qualificazione e stabilità del PRM e del WRM.

È incoraggiato l'uso di un sistema a due livelli. Resta inteso che il PRM e il WRM non sono ancora stati stabiliti. Si ricorda al Richiedente che l'implementazione del sistema a due livelli deve essere richiesta in una domanda di variazione di Tipo II.

Caratterizzazione

Delucidazione della struttura e di altre caratteristiche

La caratterizzazione analitica è stata eseguita sul lotto di sostanza farmaceutica BNT162b2 20Y513C101, prodotto da DS Process 2 su scala commerciale. Questo è stato trovato accettabile.

La caratterizzazione fisico-chimica ha coinvolto la struttura primaria, la struttura del cappuccio 5 ', la coda poli A e la valutazione della struttura di ordine superiore. La struttura primaria è stata confermata dalla mappatura degli oligonucleotidi. E il metodo ortogonale, il sequenziamento dell'RNA utilizzando la tecnologia MiSeq Next Generation Sequencing (NGS) Illumina. I risultati confermano la sequenza dell'RNA. Il cappuccio da 5 'e la coda di poli A da 3' sono stati confermati da due metodi LC-UV / MS separati. È stato dimostrato che la forma predominante del terminale 5 'è la sequenza nucleotidica a tutta lunghezza con il cappuccio 5', ma che esistono anche altre specie minori tra cui specie fosforilate, troncate ed estese. L'analisi della coda A in polietilene 3 'ha dimostrato che BNT162b2 DS contiene la coda prevista, ma che c'è una certa eterogeneità dovuta allo slittamento trascrizionale. La struttura di ordine superiore di BNT162b2 mRNA DS è stata caratterizzata in soluzione utilizzando la spettroscopia di dicroismo circolare (CD). Nel complesso, sono stati applicati metodi all'avanguardia per la caratterizzazione fisico-chimica ei risultati hanno confermato la sequenza e gli attributi di qualità attesi.

Una grave carenza della sezione caratterizzazione è che non viene presentata alcuna caratterizzazione biologica e che la modalità di azione non è descritta. Ciò non è stato ritenuto accettabile e il fascicolo dovrebbe essere aggiornato con le informazioni pertinenti. Anche se non è possibile eseguire una caratterizzazione biologica completa su DS, la strategia per determinare la potenza e i relativi saggi funzionali dovrebbe essere descritta nella sezione 3.2.S.3. I risultati ottenuti sulla DP potrebbero essere inclusi, per dimostrarne la funzionalità. Inoltre, si osserva che nella sezione Storia dello sviluppo e comparabilità (3.2.S.2.6), la dimensione della proteina espressa viene valutata mediante espressione in vitro seguita da Western blot. I risultati ottenuti con questo metodo potrebbero essere considerati una caratterizzazione biologica e dovrebbero essere inclusi nella sezione 3.2.S.3.

Impurità

In questa sezione vengono descritte le impurità correlate al processo e al prodotto, nonché i potenziali contaminanti. Cinque lotti sono stati valutati per le impurità, vale a dire clinica, fornitura di emergenza iniziale e lotti PPQ.

L'unica impurità correlata al prodotto trattata è l'RNA a doppio filamento, derivato dalla reazione di trascrizione in vitro. I risultati dei cinque lotti DS dimostrano che il livello di RNA a doppio filamento è basso, accettabile e coerente.

Oltre all'RNA a doppio filamento, ci sono più impurità legate al prodotto, cioè RNA troncato, indicato anche come specie frammentata. L'RNA troncato si riflette nella specifica DS in termini di integrità dell'RNA. Tuttavia, la caratterizzazione di BNT162b2 DS non è attualmente ritenuta accettabile in relazione all'integrità dell'RNA CQA. Per questo attributo specifico si osservano differenze significative tra i lotti prodotti dal Processo 1 e 2. Anche se due metodi, vale a dire l'elettroforesi su gel di agarosio e l'elettroforesi su gel capillare, sono stati applicati per determinare l'integrità dell'RNA di BNT162b2 DS, non vengono presentati dati di caratterizzazione sulle forme troncate e i potenziali rischi per la sicurezza associati alle isoforme di RNA troncate non vengono affrontati. Ciò è particolarmente importante considerando che gli attuali criteri di accettazione DS e DP consentono fino al 50% di specie frammentate. Pertanto, il fascicolo dovrebbe essere aggiornato con ulteriori dati di caratterizzazione e discussioni sull'integrità dell'mRNA, questa è considerata una delle principali obiezioni.

Lo stampo di DNA residuo è un'impurità correlata al processo derivata dallo stampo di DNA linearizzato aggiunto alla reazione di trascrizione in vitro. Lo stampo di DNA residuo è controllato da qPCR come definito nella specifica DS e si è dimostrato che i livelli per tutti e cinque i lotti sono ben al di sotto dei criteri di accettazione. Ulteriori impurità correlate al processo, inclusi nucleosidi trifosfati (NTP) e struttura di capping, piccole molecole ed enzimi, vengono valutate e valutate nella Sezione 3.2.S.2.6 Valutazione del rischio di potenziali impurità correlate al processo. Tenendo conto della sezione 3.2.S.2.6, le impurità legate al processo sono sufficientemente descritte. Rimane qualche incertezza sull'approccio per determinare i livelli di T7 RNA polimerasi e proteinasi K.

I potenziali contaminanti descritti in questa sezione sono l'endotossina e la carica batterica. Sono mostrati risultati accettabili per il pool di proteinasi K, il pre-recupero del retentato di UF, il pool di prodotti UF e la sostanza farmacologica.

E' possibile scaricare il documento completo presso il seguente indirizzo : Rapporteur Rolling Review Report Overview LoQ - COVID-19 mRNA Vaccine BioNTech.docx (inglese)

Tradotto in italiano : Rapporteur Rolling Review Report Overview LoQ - COVID-19 mRNA Vaccine BioNTech (ITA).docx